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分化诱导剂对脊索瘤细胞体外粘附、移动和侵袭的作用

文献摘选:作者:王育才
【关键词】  脊索瘤

    Study on effects of differentiation inducer on adhesion, movement and invasion of chordoma cell line in vitro

  WANG YuCai, FAN QinYu, ZHANG DianZhong, SHAN LeQun,YING Yan

  Deparment of Orthopaedics Surgery, Tangdu Hospital,  Fourth Military Medical University, Xian 710038, China

  【Abstract】 AIM:  To explore the effects of differentiation inducer (HMBA) on the adhesion, movement and invasion of chordoma cell line (CM319) in vitro. METHODS:  CM319 cell lines were induced by HMBA (2 mmol/L) in vitro, the adhesion of the cells was detected by MTT and the movement and invasion of the cells were detected by Millicell PCF culture system. RESULTS:  The adhesion rate of the cell line induced by HMBA reduced 27% and 31%, respectively after 30 min and 90 min culture in vitro. The suppression rate of movement and invasion of CM319 induced by HMBA was 65.5%  and 69.85%, respectively. CONCLUSION:  HMBA has some antiinvasion  effects on the human chordoma cell line (CM319).

  【Keywords】  Chordoma; Cell line; differentiation inducer; invasion

  【摘要】 目的: 探讨分化诱导剂六亚甲基二乙酰胺(hexaethylenebisacetamide, HMBA)对人脊索瘤CM319细胞体外粘附、移动和侵袭的作用. 方法: 用2 mmol/L HMBA体外诱导培养CM319细胞;用MTT(thiazalylblue,噻唑蓝)比色法测定细胞在重构基底膜Matrigel上的粘附;用Millicell PCF培养系统测定细胞的移动性和侵袭性. 结果: 分化诱导剂HMBA诱导的CM319细胞在30 min和90 min粘附实验中的粘附率,分别下降了27%和31%. 分化诱导剂HMBA对CM319细胞体外移动和侵袭的抑制率分别为65.50%和69.85%.  结论: 分化诱导剂HMBA对人脊索瘤CM319细胞具有抗侵袭作用.

  【关键词】 脊索瘤;细胞系;分化诱导剂;侵袭性

  0引言

  脊索瘤起源于残留的脊索组织具有侵袭性强、转移和易复发的特点. 探索新的抗侵袭方法,将有助于减少肿瘤的侵袭和转移.  分化诱导剂六亚甲基二乙酰胺(hexaethylenebisacetamide, HMBA)能有效地诱导体外培养的人肿瘤细胞向良性方向分化,降低其恶性表型[1]. 我们探讨分化诱导剂HMBA对人脊索瘤CM319细胞[2]体外粘附性、移动性和侵袭性的作用.

  1材料和方法

  1.1材料

  人脊索瘤细胞系CM319,由我科建立. 细胞用含100 g/L小牛血清(杭州四季青公司生产)的RPMI1640培养液(美国Gibco公司),在37℃, 50 mL/L CO2及饱和湿度环境中培养.  HMBA (中国科学院兰州化学物理研究所提供),用三蒸水配制为0.5 mol/L的母液. 实验时用培养液稀释至2 mmol/L. 2.5 g/L胰蛋白酶消化CM319细胞,用含HMBA的培养液体外诱导培养4 d. 然后,收集细胞进行以下实验.

  1.2方法

  体外粘附性的测定参照文献[3]进行. 重构基底膜Matrigel (Collaborative Research公司),按说明用无血清培养液以1∶8稀释,在96孔培养板中加入50  μL,无菌吹干;取HMBA诱导的和未诱导的CM319细胞100 μL(5×108/L)分别接种到含有及没有Matrigel的96孔板中,培养30, 90 min后,洗去未粘附细胞,用MTT(thiazalylblue,噻唑蓝)比色法测定粘附细胞并计算粘附率.体外移动性的测定参照文献[4]方法稍加改良,用市售的Millicell PCF塑料培养小室(呈圆桶形,直径12 mm,底部装有聚碳酸酯微孔膜,孔径12 μm(美国Millipore公司)测定细胞穿行微孔膜的能力. 将Millicell放入24孔培养板中,在Millicell内加入100 μL (5×108/L)的HMBA诱导和未诱导的CM319细胞,在Millicell外室加500 μL起趋化作用的条件培养液(用NIH3T3细胞系制备条件培养液[7]). 培养8 h后,取出Millicell, PBS洗涤,30 g/L戊二醛固定, Giemsa染色,用棉签小心擦去微孔膜上层细胞,在倒置显微镜高倍视野下,计数取景框中移至微孔膜下层的细胞. 每个样本计数10个视野.  体外侵袭性的测定: 按上述方法3,在Millicell内微孔膜上铺一层重构基底膜Matrigel,将Millicell放入24孔板中. 在Millicell内加入100 μL(5×108/L)的HMBA诱导和未诱导的CM319细胞,在Millicell外室加500 μL条件培养液,培养20 h后,取出Millicell,按方法4进行固定、染色、计数.
 
  统计学处理: 数据处理用两因素方差分析及秩和检验方法,统计学处理用SPSS 12.0完成.

  2结果

  2.1HMBA对CM319细胞粘附性的影响CM319细胞在重构基底膜Matrigel上的粘附率明显大于在塑料表面的粘附率. 2 mmol /L的HMBA能显著抑制CM319细胞在Matrigel上的粘附,30 和90 min的粘附率则分别下降了27%和31%(Tab 1). 但对细胞在塑料表面的粘附没有明显影响(90 min组),表明HMBA的抗粘附作用具有选择性.表1HMBA对CM319细胞体外粘附性的抑制作用(略)

  2.2HMBA对CM319细胞移动性的影响CM319细胞在NIH3T3细胞培养液中趋化因子的作用下,能从Millicell微孔膜的上方移动至膜的下方. 2 mmol /L HMBA具有抑制CM319细胞移动的能力(Tab 2). 表2HMBA抑制CM319细胞体外移动性和侵袭性(略)

  2.3HMBA对CM319细胞侵袭性的影响在Millicell微孔膜表面所铺的重构基底膜Matrigel与机体内的基底膜组分相似,肿瘤细胞通过分泌基质降解酶分解人工基底膜,才能够穿过微孔膜. 2 mmol /L HMBA对CM319细胞的侵袭性有显著的抑制作用(Tab 2).

  3讨论

  脊索瘤具有分泌黏液、侵袭性强、转移和易复发的特点. 多孔生物膜Millicell培养系统是近年来发展的一项实验技术,用于体外Matrigel侵袭实验研究. 不仅可用于研究细胞分化和细胞与基质的相互作用,还可用来筛选抗侵袭和抗移动药物. 我们研究证实,分化诱导剂HMBA对脊索瘤CM319细胞体外移动和侵袭行为有明显的抑制作用. 我们在实验中观察到,富含LN和IV型胶原等成分的Matrigel能促进CM319细胞体外粘附,而HMBA能选择性抑制肿瘤细胞对Matrigel的粘附. HMBA抑制肿瘤细胞粘附的机理目前尚不清楚,可能与影响肿瘤细胞LN受体表达有关.

  肿瘤细胞的移动性和侵袭性受到多种因素影响,蛋白激酶C(PKC)的激活能增强瘤细胞的移动性和侵袭性[6]. 已有研究发现HMBA具有抑制肿瘤细胞PKC活性的作用[7]. 本结果显示, HMBA能显著抑制CM319细胞的移动性和侵袭性,可能与抑制PKC活性有关.

  分化诱导剂HMBA对CM319细胞不仅有显著的诱导分化作用,而且有明显的抗粘附、抗移动和抗侵袭作用. 这一结果为进一步研究HMBA抗脊索瘤侵袭、转移治疗提供了实验依据.

  【参考文献】

  [1] Chen YP,Wu JZ, Situ ZQ, et al. Human mucoepidermoid carcinoma MEC1 cells induced differentiation by HMBA [J]. Chin J Stomatol, 1996;31:28-30.

  [2] Zhang DZ, Ma BA, Fan QY, et al. Establishment and characteristics of ahuman chordoma cell loine [J]. Chin J Oncol, 2003;25(3):234-236.

  [3] Han ZG, Ma CJ, Jiang WG, et al. Inhabition effect of cancer invasion inhibitive factor on tumor moving and invasion of human lung cancer cell induced by gene reorganization liver cell growth factor [J]. Modern Stomatol J, 1996;9:106-109.

  [4] Merzak A, McCrea S, Koochekpour S, et al. Control of human glioma cell growth, migration and invasion in vitro by transforming growth factorβ1 [J].  Br J Caner,1994;70:199 203.

  [5] Zhou KX, Wu BQ, Zheng J, et al. The effect of TIMPIgene transfection on biological action of human lung giant cell car cinoma cell line[J]. Chin Medical J, 1994;74:402-405.

  [6] Jiang WG, Puntis MC, Hallett MB, Molecular and cellular basis of cancer invasion and metastasis: Implications for treatment [J].  Br J Surg,1994;81:1576-1590.

  [7]Gu SQ, Liang YY, Wang YM, et al. Adjustment of HMBA on the two signal systems of gastric carcinoma different cell cycles [J].  Dev  Biochem  Biophys,1997;24:443-447.

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